薄层色谱又叫薄板层析，是色谱法中的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固—液吸附色谱，是近来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法。

    色谱法的基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能的不同，或和其它亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组份分开。薄层色谱是一种微量、快速和简便的色谱方法。由于各种化合物的极性不同，吸附能力不相同，在展开剂上移动，进行不同程度的解析，根据原点至主斑点中心及展开剂前沿的距离，计算比移值（Rf）：
    化合物的吸附能力与它们的极性成正比，具有较大极性的化合物吸附较强，因此Rf值较小。在给定的条件下（吸附剂、展开剂、板层厚度等），化合物移动的距离和展开剂移动的距离之比是一定的，即Rf值是化合物的物理常数，其大小只与化合物本身的结构有关，因此可以根据Rf值鉴别化合物。

    薄层色谱可适用小量样品（几到几十微克甚至0.01μg）的分离：也可用于多达500mg样品的分离，是近代有机化学中用于定性，定量的一种重要手段。特别适用于那些挥发性小的化合物，以及在高温下易发生化学变化而不能用气相色谱分析的物质。

    点样：将试样溶液用毛细管在层析板上距离板底部约1.5厘米的位置点若干下（次数根据样品浓度而定），并静置顷刻（或加热）以使溶剂完全蒸发。若溶剂难以挥发，则点样之后需要将板放于真空容器中干燥后再使用。溶剂的蒸发是必须的，否则残留的溶剂会与流动相作用，降低流动相的均一性，导致分离效果变差。
    将少量合适的溶剂（流动相）倒于一个合适的玻璃器皿（展缸）中，让流动相高度不超过1厘米，并在上面放上表面皿使溶剂蒸气在展缸中饱和。可在展缸底部放上一张滤纸，让滤纸底部浸没于溶剂中并靠在展缸内壁，过几分钟后让洗脱溶剂蒸发并在展缸空间内饱和。若不经过以上步骤可能会导致分离度的下降或使结果不具重复性。
    然后将层析板置于展缸内（样品点不可触碰溶剂表面），盖上盖子让溶剂通过毛细现象缓慢爬升。溶剂遇到样品混合点时，会带着样品上升（即洗脱样品）。当溶剂快到层析板顶端时，将板拿出，迅速记录溶剂到达的高度并晾干。不要让溶剂爬升到达板的顶部。

    对于确定的固定相，混合物样品中不同的化合物在层析板上爬升的速度不同，这是由于它们对于固定相的吸附能力不同，对于洗脱剂的溶解能力也不同。改变不同的洗脱溶剂，或用不同溶剂配成混合洗脱剂，化合物的分离效果可自行调节。组分在板上的分离情况一般用比移值（Rf）的大小来表征。薄层色谱板上的分离情况还可用于预测柱色谱或快速柱色谱的分离效果。
    由于薄层色谱中很难产生均匀的吸附剂涂层，且薄板的质量与吸潮程度亦参差不齐，所以即便是同一物质在同类型而不同的层析板上得到的比移值也难以完全一致。相比于纸色谱这是薄层色谱的缺点。操作中常常将标准试样与试样在同一薄板上同时展开并点上混合点，以克服这一缺点。
    化合物的分离是利用化合物与流动相之间在固定相上竞争结合位所造成的。例如：使用硅胶做为固定相的话，此固定相可以被视为极性。此时加入两不同极性的化合物，极性较强的化合物与硅胶间会有较强作用力，因此，更能抵抗流动相并与硅胶结合；极性较弱的化合物与硅胶的作用能力较差，因此更容易流动，拥有更高的Rf値。如果流动相的极性变得更强的话，这样更能够抵抗化合物与胶上结合的能力，使所有TLC片上的化合物上升到更高的位置。这样的溶剂我们称为“强”溶剂(洗脱剂)，而“弱”洗脱剂则几乎不能移动它们。“强”与“弱”的比较是取决于TLC片上的涂层(固定相)。

    以硅胶TLC片来说，洗脱剂的强度比较为：
    全氟烷(最弱)＜己烷＜戊烷＜四氟化碳＜苯/甲苯＜二氯甲烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜乙腈＜丙酮＜2-丙酮/正丁醇＜水＜甲醇＜三乙胺＜乙酸＜甲酸(最强)
    而对于C18覆盖的TLC板，其顺序完全相反。在应用中，若使用乙酸乙酯/庚烷的混合溶剂作为流动相，乙酸乙酯比例越高会导致所有化合物在TLC上的Rf值更大。通常，更改流动相的极性不会导致TLC板上的化合物斑点前后顺序发生改变。若需要更改化合物在TLC板上的前后顺序，可以选用反相TLC板，即使用非极性固定相来代替极性固定相，如C18修饰后的硅胶。

    TLC还可用于少量如100毫克左右的化合物的分离，此时混合物样品不是“点”在板上，而是涂抹在TLC板上且高于洗脱剂液面上的位置，形成一条水平的样品带。然后如同展开小型TLC板一样将制备TLC板展开并晾干，然后将每条携带不同化合物的色带从板上分别刮下，并用合适的溶剂萃取洗涤（如二氯甲烷）并过滤掉固定相等不溶物，得到滤液后再脱除溶剂就得到纯净的化合物。对于小量且易于分离的反应产物，制备TLC较柱色谱在时间、效率和经济上更占优势。显然，这种方法得到的TLC板不可用全部用化学方法显色，否则会导致样品全部损失。因此可使用一些不会破坏样品的显色方法，如紫外线。或者，可刮下板上部分的吸附相进行鉴定，也可以割下部分的TLC板用显色剂（如碘）找到需要的化合物。

    由于被分离出的化学品可能是无色的，因此下列几种方法可用于让没有可见光吸收的斑点显色：
通常在可使用少量的荧光化合物，如锰－活化的锌硅酸盐加入到吸附相当中，使得吸附物在黑光（UV254）下可以显色。固定相在荧光下本身显绿色，因此化合物的斑点可以掩盖掉荧光下的绿色从而达到显色目的。
    碘蒸气是对于大多数化合物都是显色试剂。
    许多化合物的斑点可以通过将TLC板浸没于下列显色剂当中而达到显色目的，如：高锰酸钾，碘，溴，磷钼酸，茴香醛法与茚三酮。
    脂类的情况下，色谱图可能会被转移到PVDF膜上，然后受到进一步的分析，如质谱法，这种技术称为Far-Eastern blotting。
    当显色成功后，就可以计算出Rf值，或保留因子。其计算方法是测量每个点从原点到达最终停留位置的距离除以原点到溶剂前沿的距离。这些值取决于使用的溶剂与TLC板的材质，而与物理常数无关。

    手工铺制层析板耗费时间较长，为方便使用，目前可以直接从市场上获取标准的层析板。商用层析板一般会标注G、H、GF、HF；其中G表示凝固剂，H则不含凝固剂，G的价格通常低于H；F则代表荧光。

    铺板→点样→展开→显色→计算Rf值

    在有机化学中，有机反应可通过TLC进行定性的检测。使用毛细管将样品点于TLC板上：一个点表示起始原料，一个点表示反应体系，一个点表示两者“混合点”。一个小型TLC板（3X7cm）只需几分钟就可以完全展开。整个分析过程是定性的，它可显示起始原料是否消失即是否反应已经完成；是否有产物出现以及产生了多少产物。需注意的是，从低温环境中取样的TLC结果可能会出现误差，因为样品的温度在毛细管中就已经升至室温，其与低温反应瓶内的反应将不一样。例如DIBAL-H还原酯制备醛的反应。

    现代薄层色谱基本都是由各种仪器来代替，以消除在实验过程中的诸多影响因素。这也是国内科技发展的大趋势，逐渐取代人为因素在实验过程中的影响，从而达到重现性的效果。
    在应用方面也是多种多样，在制药、食品、保健品、化妆品、法检、饲料、工业等方面均有较广泛的应用。