1、培养基

有些细菌对培养基中的成分有特殊的要求，特殊的菌要用特殊的培养基才能进行药敏试验。培养基中还有适量的Ca、Mg，在培养基中起到溶酶的作用，其含量的变化，可影响氨基糖苷类和四环素对铜绿假单胞菌的试验结果，含量过高，抑菌圈会变小，含量过低，抑菌圈会大得不可接受。

细菌药敏试验的培养基厚度大约为4mm，若培养基厚度大于4mm，会使细菌出现耐药；若小于4mm，本应耐药的易出现敏感。所以，试验时一定不要把药敏纸片放在中央部位，而应均匀地排布在平皿周围的培养基上。

2、药物浓度

药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。

3、药敏纸片

药敏纸片材质的好坏，对药物稳定性和活性有很大影响。加工药敏纸片的试纸一般是使用加厚型的滤纸，杂质少，对药物保存无太大影响。然而，临床中很多用的是普通纸，被水浸润后会呈碱性，并且含有大量无机离子，因此使用普通纸加工的药敏纸片药物有较大的影响。

纸片在用前必须检验其片间差和准确度，只有都达到标准要求后才能使用。同时要注意纸片的保存，因为有的纸片，如青霉素类，在保存中因为受潮湿环境的影响容易降低其药物的活性。因此，纸片应放低温下(-10℃)保存，同时要避免潮湿，以保持抗菌药物的活性。

4、细菌

由于各种菌对药物的敏感性不同，产生的抑菌环大小不同，如果菌种不纯，试验中所产生的抑菌环大小与该菌种在纯培养状态下产生的抑菌环大小存在较大的差异，影响判断结果的准确性。因此需要对各种致病菌提纯后，分别进行不同的药敏试验。

药敏试验中要将菌液均匀地涂在培养基上，使细菌均匀分布，这样才能使试验结果不会出现较大的偏差。涂菌后15min才能贴药敏纸片。由于涂菌后，细菌要有一段时间的适应过程，但是时间不能过长，否则会使细菌产生耐药。

5、培养时间

一般培养温度为37℃，时间为 8-18小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的平板培养基，先置4℃冰箱内2～4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较大的抑菌圈。