PEPCK(EC 4.1.1.32)广泛存在于动物、开花植物、藻类、部分真菌和细菌中。该酶催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸,是调节糖异生途径的**限速酶。

PEPCK催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO₂，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PEPCK活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容：

溶液的配制：

1.试剂二：临用前加入15ml试剂一溶解。可溶解后分装-20℃保存，避免反复冻融。

2.试剂三：液体置于试剂瓶内EP管内。临用前加入蒸馏水按体积比1：120稀释，现用现配。

3.试剂四：液体置于试剂瓶内EP管内。临用前加入蒸馏水按体积比7：250稀释，现用现配。

4.试剂五：粉剂置于试剂瓶内玻璃管内。临用前加入2.5ml蒸馏水充分溶解；可溶解后分装-20℃保存，避免反复冻融。

5.工作液的配制：将试剂二、试剂三、试剂四按 7:1:1(V:V:V)的比例配制工作液，工作液现用现配。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献) ：

1.组织：按照组织质量(g)：提取液体积(ml)为  1：5～10的比例(建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液)进行冰浴匀浆，然后8000g，4℃，离心10min，取上清，置冰上待测。

2.细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(104个)：提取液体积(ml)为500～1000：1的比例(建议500万细菌或细胞加入1ml提取液)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次)；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3.血清(浆)样品：直接检测。

二、测定步骤：

1.紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2.将工作液置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热5分钟。

3.操作表：在微量石英比色皿/96孔UV板中依次加入下列试剂：

三、PEPCK酶活计算：

(1)按蛋白浓度计算酶活定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PEPCK酶活(U/mg prot)= △A÷(ε×d)×10⁹×V反总÷(V样×Cpr)÷T= 3215.4×△A÷Cpr

(2)按样本质量计算酶活定义：每g组织每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PEPCK酶活(U/g鲜重)= △A÷(ε×d)×10⁹×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T=3215.4×△A÷W

(3)按照细菌或细胞数量计算

酶活定义：每104个细菌或细胞每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PEPCK酶活(U/10⁴cell)= △A÷(ε×d)×10⁹×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T=6.43×△A

(4)按照血清(浆)体积计算

酶活定义：每毫升血清(浆)每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PEPCK(U/ml)＝△A÷(ε×d)×10⁹×V反总÷V样÷T=3215.4×∆A

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/ mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，0.0002L； V样：反应体系中样本体积，0.01ml；V样总：加入提取液体积，1ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g，T：反应时间：1min；500：细菌或细胞总数，500万；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm(96孔板光径)进行计算即可。

注意事项：

1.当A1小于1或△A小于0.6时(96孔UV板是当A1小于0.6或△A小于0.4时)，建议将样品稀释适当倍数后再进行测定，以提高检测灵敏度。

2.酶活性高的样品如动物肝、肾等组织，建议将提取液稀释5倍或5倍以上测定。

3.空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过0.06。

4.加样、混匀等步骤要迅速，秒表计时要准确。