磷脂酶C(EC 3.1.4.3)是一种水解甘油磷酸酯C₃位点甘油磷酸酯键的脂类水解酶，广泛存在于微生物及动植物的组织和细胞中，在细胞代谢、细胞传递、生长发育等方面具有重要作用。

磷脂酶C催化水解NPPC产生对硝基苯酚，在410nm处有特征吸收峰。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容：

需自备的仪器和用品：

天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。

操作步骤：

一、酶液提取

1.组织：按照质量(g):提取液体积(ml)为1:5～10的比例(建议称取约01g，加入1ml提取液)加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心5min，取全部上清于4℃、100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1ml试剂一。

2.细胞：按照细胞数量(104个)；提取液体积(ml)为500～1000:1的比例(建议500万细胞加入1ml提取液)，冰浴超声波破碎细胞(功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min)；然后于4℃，10000g离心5min，取全部上清于4℃、100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1ml试剂一。

3.血清：直接测定。

二、测定操作

三、酶活计算公式

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线:y=0.0191x-0.0103，R2=0.9991

1.按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性(nmol/min/mg prot)=(△A+0.0103)÷0.0191×V反总÷(V样×Cpr)÷T=17.45×(△A+0.0103)÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活性定义：每克组织每分钟水解NPPC产生lnmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性(nmol/min/g鲜重)=(△A+0.0103)÷0.0191×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T=17.45×(△A+0.0103)÷W

3.按照细胸数量计算

酶活性定义：每104个细胞每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性(nmol/min/10⁴cell)=(△A+0.0103)÷0.0191×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量)÷T=17.45×(△A+0.0103)÷细胞数量

4.按照液体体积计算

酶活性定义：每毫升血清每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性(nmol/min/ml)=(△A+0.0103)÷0.0191×V反总÷V样÷T=17.45×(△A+0.0103)

V反总：反应总体积，0.2ml；V样：加入样本体积，0.02ml；V样总：加入提取液体积，1ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；W：样本质量，g；T：反应时间，30min

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y=0.0095x-0.0103，R2=0.9991

1.按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性(nmol/min/mg prot)=(△A+0.0103)÷0.0095×V反总÷(V样×Cpr)÷T=35.09×(△A+0.0103)÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活性定义：每克组织每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性(nmol/min/g鲜重)=(△A+0.0103)÷0.0095×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T=35.09×(△A+0.0103)÷W

3.按照细胞数量计算

酶活性定义：每104个细胞每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性(nmol/min/10⁴cell)=(△A+0.0103)-0.0095×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量)÷T=35.09×(△A+0.0103)÷细胞数量

4.按照液体体积计算

酶活性定义：每毫升血清每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性(nmol/min/ml)=(△A+0.0103)÷0.0095×V反总÷V样÷T=35.09×(△A+0.0103)

V反总：反应总体积，0.2ml；V样：加入样本体积，0.02ml；V样总:加入提取液体积，1ml ；Cpr:样本蛋白浓度，mg/ml；W:样本质量，g；T：反应时间，30min。