误区1：色谱柱填料粒径越小、压力越高，分离效果越好

观点错误！

超小的粒径以及超高的柱压，并不一定是色谱工作者的最佳选择！

现代色谱柱的柱特性研究已经引发出一些新方法来评估一根色谱柱的性能。例如，采用新的表面多孔材料的色谱柱，其柱效与sub-2μm UHPLC柱效一样好，然而与常规的LC填料色谱柱比起来，柱压很低。

误区2：你不可以将高效液相色谱柱反接以便于冲洗掉其中的颗粒物

观点错误！但有时候是正确的！

实际上HPLC色谱柱的填装压力比最大使用压力高很多（通常会高2倍）。如果装柱时使用了恰当的匀浆剂，并且分配一定的时间使柱床稳定，一支填装良好的色谱柱是完全可以双向使用的。

液相色谱柱上基本都有—>标志，表示流动相的流动方向，有的在色谱柱上印有“Nerver Lot Flow in the OppositeDirection”字样，翻译成“决不能反冲”的意思，色谱柱可以反冲吗、色谱柱能不能反冲的问题争议很大，但在我们工作中，用色谱柱反冲技术修复色谱柱收到柱效提高、柱效恢复的效果。

一、分析氨基酸的离子交换柱，使用一段时间反柱效明显下降，用NaOH活化，达不到要求，但用NaOH反冲活化可迅速恢复柱效 

二、色谱柱使用一段时间后柱效下降，此时可拆下柱入口端螺帽，去掉1-2mm被污染填料，再用相同填料填满，然后用流动相反冲一下，可使柱效恢复，因反冲可以改善柱头死空间。

三、因反冲可把沉积在过渡板上的细微颗粒冲走，有时也可用反冲技术使柱压降低。

反向使用色谱柱有一个例外，就是生产商在色谱柱的进样端使用了孔径更大筛板的情况，反向使用可能会将填料从柱床冲出。如果制造商在柱的入口处使用的是高孔隙率的玻璃料，那么将柱反冲的话，可能会将柱填料从填充床上冲洗掉。色谱柱在工厂填装时，出口端的筛板孔径必须比色谱柱中最小颗粒的粒径还要小。譬如，色谱填料平均粒径是5μm，粒径分布范围是3-7μm，出口端筛板孔径必须小于3μm，使填料没有可能从柱床跑到色谱柱筛板外面。大多数生产厂家选择的筛板孔径是2μm。 至于某些厂家两端的柱筛板孔径不一样，一般是进样端大些，出样端小些。因此，一些制造商会在柱子标签处放置一个箭头指示，表明必须仅在一个方向上使用。可以肯定有这种可能性，所以一个色谱工作者应该好好阅读色谱柱手册或说明书，或与制造商确定这根色谱柱是否可以反冲。

误区3：柱压不会影响色谱分离效果

观点错误！

色谱的很多参数都是受柱压影响的，包括部分溶质的摩尔体积、停滞体积、柱孔隙度、保留因子、流动相密度、介电常数、固定相结构、pH值和电离常数等。为什么柱压引起了越来越多的关注呢？原因是市售的色谱仪很多是超高压色谱仪和色谱柱。当色谱柱在约2,000psi(13.789MPa)压力下运行时，即使保留时间上存在小差异，也并不会引起我们的注意；特别是如果重复性较好及定量不受影响的时候。但是，当柱压接近2000psi(13.789MPa)时，柱压的影响可能就相当明显了。

误区4：保护柱是没必要的

观点错误！

使用保护柱有很多好处。首先，保护柱可以防止化学物质或颗粒物损坏分析柱。其次，相较之更换一根昂贵的分析柱，更换一根5mm 的保护柱只需要很少的花费。现代的保护柱具有几乎无死体积、更换快速，以及适用于UHPLC的高压等优点。

误区5：相较之纯的多孔粒子，表面多孔颗粒会显著降低样品容量

观点错误！

HPLC色谱柱填料对样品的容量是与其表面积成正比的，这与硅醇基通过单体键合形成的化学键合相的量相关。然而，研究结果表明：在相同的试验条件下，表面多孔颗粒与多孔粒子对样品的容量是基本上相同的。

误区6：至少需要10个柱体积才能重新使LC色谱柱达到平衡

观点错误！

平衡时间对于梯度色谱来说是非常重要的，因为它是整个技术的限制因素。这有两种平衡类型：重复平衡和完全平衡。重复平衡也就意味着在无法实现完全平衡的情况下达到的平衡。实际上，如果在随后的运行中，保留时间的重复性是小于0.002 min的，然后对于非离子化溶质的无缓冲洗脱剂和碱性化合物以常用的三氟乙酸和甲酸为添加剂的话，重复平衡在两个柱体积的范围内即可实现。

误区7： 超高效液相填料柱比常见的高效液相填料柱更容易堵塞

观点错误！

随着柱填料多孔材料粒径的不断减小，使得柱的主要硬件设计跟着一起发生变化。对于sub-2μm UHPLC柱的堵塞，是样品和流动相物质倒伏在柱入口的结果。如果你在进样前对样品进行了净化，如使用固相萃取、过滤或离心等，就可以避开任何污染问题。

误区8：反相色谱柱不可以使用纯水相

观点错误！

这个误解其实是起源于有些用户在使用低有机溶剂含量或者纯水作为反相色谱柱的流动相时，发生了俗称相塌陷的现象，所以大家就认为反相色谱柱不可以使用纯水相。许多色谱工作者都被相塌陷现象和保留时间位移现象困扰着，甚至已经失去了努力寻找解决途径的耐心。因此，他们索性就认为不应该在反相色谱柱中运行水含量很高的流动相。然而，事实上市售的反相色谱柱（如极性嵌入和极性封端柱）都是具有水浸润性的，其表面特性是允许使用纯水的，而不会导致塌陷或者保留时间移位。比如科思美析COSMOSIL的C18-PAQ系列则可以使用100%水作为流动相，适合分离亲水型化合物，并相较于传统的十八烷基键合硅胶色谱柱，具有很强的抗酸性。

误区9：空气会彻底毁灭一根高效液相色谱柱

观点错误！

当色谱柱不与色谱仪连接的时候，用户需确保色谱柱被紧紧地密封。事实上，实际的应用中是，即使柱的端部进入了少量的空气也不要紧。因为当你将色谱柱连接到色谱仪上使用时，在系统初始加压阶段，在很短的时间内空气就会被溶剂冲刷掉。所以，不要因为色谱柱进入了空气而认定色谱柱已被损坏。

误区10：提高温度往往有利于分离效果

观点错误！

随着温度升高，流动相粘度下降，因此分析物传质速率提高，所以就能够提供更好的色谱分离效果。除了柱效，温度同样影响保留因子（k）和选择性（α），温度的变化因素能够提高或降低分辨率（其实这也是色谱分析最关心的问题）。保留时间往往随着温度升高而降低，因为温度作为一个热力学参数，使得高温度下分析物倾向于留在流动相中，会更快的从柱子上洗脱下来。然后，不同的化合物可能对温度变化有不同响应程度的保留时间改变。更加确切的说，它们的范德霍夫线的斜率不同（lnk与1/T，T以绝对温度计量）；换句话说，α值会变化。另外温度增加会使低k值的色谱峰出峰更快，甚至接近在无保留物质t0附近出来，导致很难进行定量分析。

以analgesics(一种镇痛药，译者注)为例，图二显示的一系列的色谱图列出了七种镇痛药在柱温20-90℃的分离情况。我们从中可以发现许多特点。首先，所有分析物随着温度升高，保留时间变短且峰变窄，意味温度升高利于分离效果。其次，镇痛药之一的水杨酸（即阿司匹林）在峰5，6之间，随着温度变化位置改变较大。事实是在20-40℃时，该物质随温度变化，洗脱顺序也发生了变化。在中间的30℃时，水杨酸和第6号峰的非那西丁一起出峰。

所以，温度大于40℃会引起分离时间变短和洗脱顺序发生变化。当然，一个提高温度的好处在于降低了操作时的柱压，以便于使用更大的流速和粒径更小的填料。另一个在高温下能够导致色谱柱性能问题的因素是流动相的温差。如果柱子在60℃下操作，但是流动相在室温流入，那么进入的较冷的流动相就能够引起峰变形，原因是不同温度下分析物会趋向在高温的流动相中。所以建议大家在较高温度下使用色谱柱的时一定记得预热流动相。

误区11：碳载量越高，反相色谱柱就越好

观点错误！

谈到普通的烷基键合相时，这样的结论看来是对链长、载碳量和表面键合度等概念有误解。通常，对一个真正的反相保留机制来说，保留能力取决于被分析分子的相对疏水性，所以保留一般取决于载碳量。载碳量越高，保留能力越强。载碳量一般与链长成正比，但并不是必然如此。

典型的色谱硅胶表面，可用于和有机硅烷试剂键合反应的硅醇含量在8.0μmol/m²左右。假设在所有的硅醇基上都能实现单层键合，则链长越长，载碳量就越大，结果是保留能力与链长成正比。短链键合相（比如C8），如果表面键合度相对更高，那么键合的碳就会更多，就会导致可能比C18有更加强的保留能力。

此外，一些厂家使用二氯硅烷和三氯硅烷做键合试剂，由于聚合反应的发生通常能增加固定相的键合率。这种情况下，短链聚合键合相会比长链单体键合相的键合度高很多。对比单体键合相，聚合物键合相的键合层较厚，有时会引起传质速度变慢。高载碳量的反相柱更加容易发生相塌陷。对于这些色谱柱，当流动相中有机相比例降到10%以下的时候，疏水固定相之间就会倾向于互相结合（self-associate），而不是处于在极性水溶液中的溶解状态（即相似相溶）。所以，高碳载量反而可能对反相色谱性能有害，而且保留时间的重现性也不好。

误区12：所有的C18（L1）色谱柱都是一样的

观点错误！

美国药典委员会（USP）开发了一种分类系统，用来对每种类型的键合相柱进行分类。由于C18色谱柱是一种广泛应用的色谱柱，故该系统将其称为“L1”。可惜不幸的是，大约有800种以上的L1流入了市场，因此，事实证明这个系统是不可靠的，是一个令人困惑的系统。因为每种商品化的C18色谱柱，虽然同样是选用硅胶作为基体，但各自都有自己特定的填料键合合成工艺，因此色谱性能也不相同。 譬如，有的生产厂商采用十八烷基一氯硅烷键合试剂和低表面积的硅胶，而其它一些厂家采用同一硅烷试剂但选用了表面积更高的硅胶基体。这两种C18柱表现的色谱性能不同，后者C18固定相的键合比例大于前者。较低的固定相键合比率，表面未反应的硅醇基较多，有时混合保留机理起主要作用。某些色谱柱生产商使用二氯硅烷和三氯硅烷作键合试剂，将键合相聚合反应形成一很厚的具有不同扩散特性的疏水层。为使键合后硅胶表面未反应的硅醇基比例降低，有些生产商用小分子的硅烷试剂（如三甲基氯硅烷）封尾。硅醇基是在中性条件下测定碱性物质时导致色谱峰拖尾的原因之一，有些生产厂家，更进一步的做法是采用第二种小分子硅烷进行双封尾工艺，以提供一个更加惰性（疏水性）的硅胶表面。另外有些生产商采用聚合物基体材料进行C18 键合，生产出一种完全不同的C18填料，但仍然被归类到“L1”。还有厂家采用反应性能不同的硅烷化试剂organoalkoxysilanes，制造出一种与氯硅烷反应产生的不同的C18 固定相。

误区13：对于硅胶填料，残留的硅醇基是造成拖尾的原因

观点错误！

特定条件下，硅胶基质键合柱上存在的硅醇基，尤其是在分析碱性物质时，能够造成峰拖尾。拖尾的原因在于硅醇基团本身就是一个弱酸，pKa大约在4.5和4.7之间。因此如果流动相pH值在4到5的时候，硅醇就会离子化，并与诸如质子化的胺类等带正电荷的分子通过静电引力发生作用。可以通过将pH降到3以下来抑制硅醇基的离子化的方式尽量减小该种作用。但是对于许多碱性化合物，在低pH条件下也能够发生拖尾。有经过特别设计的专门的反相色谱填料，对碱性化合物的测定，能获得好的峰形。

三种原因能够造成拖尾，化学问题、柱填充问题和色谱设备硬件问题。三种问题都可以造成拖尾，但是要解决问题，就需要找到问题的根源。详细探究这三种原因超出了本文的范围，这里就三种类型的问题分别举几个实例，使大家有一个大概的认识。

首先，除了硅醇基的作用外，化学因素的拖尾还有其它几种方式。与金属产生螯合作用的化合物与色谱填料中的痕量金属作用引起的拖尾，在早期的硅胶基质中特别明显。错误的进样溶剂选择能够导致拖尾。样品中不容易洗脱的强保留组分和流动相中的杂质在柱头的逐步累积也可导致拖尾，这些在柱头累积的物质能扮演不同的固定相角色，与经过的分析物作用而导致分析物峰形拖尾。有时，存在混合模式的保留作用也能够诱发拖尾，如分析物与活性基团既有反相作用也有离子相互作用的情况。有时候，流动相pH选择错误，样品部分离子化，分子态和离子态共存，混合模式作用就能够导致峰扭曲和拖尾。此外，一个大的色谱峰后面如恰好有一个洗脱出峰时间相差不大的的小峰，看上去也和拖尾一样。

柱子的填充质量不好也可以导致拖尾。柱头的填料空隙可以导致峰分叉或者拖尾。如果柱子没有填充好，柱床上有微小的沟槽就能够使峰形过宽。进样浓度过大，样品过载也会导致拖尾，样品过载导致峰前延的情况更常见。如果样品进得少了，因为过多的硅醇基存在，也能够导致拖尾。

接下来来讨论下仪器硬件问题导致拖尾的情况。前面说的管路死体积和接头体积能够导致拖尾。进样时的瞬间加压可以造成柱头填料塌陷（有空洞形成）从而引起拖尾。反应比较慢的检测器用来检测快速洗脱出的分析物时会形成峰展宽和拖尾（和流通池厚度，长度有关）。前文说的柱操作温度和流动相温度不一致也会引起拖尾。所以说，造成HPLC拖尾的不总是硅醇基。

误区14：硅胶填料只能够在pH为2到7使用

观点错误！

反相柱的化学毁坏机理通常有两种：在pH低于2时，硅氧键的催化水解；在pH大于7或8的时候，硅胶被水中OH^-离子溶解。

pH小于2的时候，-Si-O-Si-可以被水合氢离子H₃O⁺进攻，固定相就会流失断裂。随着时间的推移，随着载碳量下降保留值会慢慢下降。有三甲基氯硅烷等短链封端的色谱柱，由于封端试剂更易水解流失，这种现象更为明显。长链C18固定相因为空间位阻效应，对于这样一种流失有一定的保护作用，但是最终仍然是慢慢被侵蚀，尤其是温度高于环境时。空间保护、高密度键合有助于防止硅胶键合相的流失。聚合固定相在这种条件下表现良好，但是比起硅胶固定相，其柱效要低。在高pH方面，一定需要有保护硅胶基体免于氢氧根离子进攻的措施。一旦溶解过程开始，随着柱床内空洞出现，色谱柱会最终失效。所以开发了双硅烷交联C18（bidentate C18）、有机无机杂化颗粒以及聚合物包覆硅胶等耐高pH的特种色谱柱。这些柱子都使用了化学方法来保护固定相避免OH^-的攻击。上述的特种柱子能够承受pH=11-12的条件。在此碱性pH条件下，柱子要避免高温使用。当然，聚合物色谱柱能够在pH=13甚至14的条件下使用，但是，前文已经指出，聚合物柱比硅胶柱柱效要差些。

因此，在这个论点上，特殊的硅胶柱能够在pH=2-7以外的范围使用，但是普通硅胶色谱柱要格外小心，由其是在高温条件下。

误区15：当代高效液相柱至少应该承受1000次进样

观点错误！

现代高效液相色谱柱能够承受的进样数量由许多因素决定。有些因素基于以下色谱作用的模式不同而不同：反相色谱，离子交换色谱，排阻色谱，正相色谱，手性色谱，亲水交互色谱等等。有些因素基于不同的填料基体：硅胶基质，杂化基质，氧化锆基质，聚合物基质，或者是凝胶和有一定交联度的聚合物树脂。有些因素基于固定相本身的一些特性：表面键合度、键合方式、聚合还是单层键合、或者是聚合物包覆。其他的因素和色谱应用条件有关：pH、温度、流动相组成、缓冲液组成、流动速率、压力等等。还有些和样品有关：完全标样、样品洁净度、样品pH、样品体积（含量）、样品杂质、分析物分子本身特性等。如果一根柱子被滥用，比如在pH范围外，或者流速范围外，很有可能连50次进样都成问题。如果样品里都没有强保留物质，5000次使用也不为过。如果色谱柱不在其承受力上限上连续使用，寿命会更长。如果柱子进样的样品繁杂，但是从来不冲洗除去柱子里的强保留物质，寿命必然减少。

通过对许多制药公司访问得到的经验表明，绝大多数5μm反向色谱柱在分析制剂、简单药品混合物，和标样的情况下能够承受至少1000次进样。如果样品“很脏”，比如没有进行过严格完全净化生物样品提取物，环境样品提取物，这样是达不到1000次进样的。

所以说柱子能够承受的次数不是绝对的，而是取决于柱子的类型，操作条件，样品洁净程度和柱子被滥用程度等。当然，使用保护柱或在线过滤器，柱子的寿命会延长。在很多个专业研讨会上，作者通过对听众非正式的投票调查，结果表明：只有不到15%的使用者实际记录了某支特定色谱柱能够用的次数，很多色谱工作者并不真正知道每支色谱柱到底能够使用多少次进样。