分光光度法是指应用分光光度计的分析方法，具有灵敏、准确、快速及选择性好等特点。

通常所测样品溶液浓度下限可达10^-6～10^-5mol/L，适用于测定食品中的微量组分(如肉制品中的亚硫酸盐、糖果中的二氧化硫等)。

一、原理

1.1 物质对光的选择性吸收

当光束照射到物质上时，光与物质发生相互作用，产生反射、散射、吸收或透射。

若被照射的是均匀溶液，光的散射可以忽略。

1.1.1 溶液颜色的产生

当一束白光通过某一有色溶液时，一些波长的光被溶液吸收，另一些波长的光则透过溶液。透射光或反射光刺激人眼使人感到颜色的存在。人把自身能感觉到的光定义为可见光。

在可见光区，不同波长的光呈现不同的颜色，因此溶液的颜色由透射光的波长所决定。

透射光与吸收光可组成白光，故称这两种光互为补色光，两种颜色互为补色。

1.1.2 光吸收的本质

当一束光照射到某物质或其溶液时，组成该物质的分子、原子或离子与光子发生“碰撞”，光子的能量就转移到分子、原子或离子上，是这些粒子由最低能态(基态)跃迁到较高能太(激发态)，这个作用称为物质对光的吸收。被激发的粒子约在10^-8s后回到基态，并以热或荧光等形式释放出能量。分子、原子或离子具有不连续的量子化能级，仅当照射光光子的能量hυ，与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差相当时，才能发生吸收。

不同物质微粒由于结构不同而具有不同的量子化能级，其基态和激发态能量差也不相同。

所以物质对光的吸收具有选择性。

1.1.3 吸收曲线

吸收曲线，也称为吸收光谱，描述了物质对不同波长的光的吸收能力。将不同波长的光透过某一固定浓度和厚度的有色溶液，测量每一波长下有色溶液对光的吸收程度(即吸光度)，然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，绘制的曲线即为吸收曲线。

不同浓度的同一物质，在吸收峰附近的吸光度随着浓度增加而增大，但最大吸收波长不变。若在最大吸收波长处测定吸光度，则灵敏度最高。因此，吸收曲线是分光光度法中选择测定波长的重要依据。

1.2 光吸收基本定律

即朗伯-比尔定律：

当一束平行单色光通过液层厚度为b的有色溶液时，溶质吸收了光能，光的强度就要减弱。

溶液的浓度越大，通过的液层厚度越大，入射光越强，则光被吸收的越多，光强度的减弱也越显著。

二、主要部件

尽管光度计种类型号繁多，但它们都是由相同的基本部件组成的，包括光源、单色器、吸收池和检测系统。

2.1 光源

在测量吸光度时，要求光源发出所需波长范围内的连续光谱，要具有足够的光强度，并在一定时间内能保持稳定。在可见光区测量时，通常使用钨丝灯作为光源。钨丝加热到白炽状态时会发出波长在320～2500nm之间的连续光谱。

钨丝灯工作温度一般为2600～2870K，熔点为3680K。钨丝灯的温度决定于电源电压，电源电压的微小波动会引起钨灯光强度的很大变化，因此必须使用稳压电源。

在紫外区测量时，常采用氢灯或氘灯产生波长在180～375nm之间的连续光谱作为光源。

其理想光源应具有覆盖整个紫外可见光区的连续辐射，强度应比较高，且随波长变化能量变化不大，但在实际上难以实现。

氘灯辐射强度比氢灯高2～3倍，寿命也比较长。氙灯的强度一般高于氢灯，但欠稳定，波长范围180～1000nm，常用作荧光分光光度计的激发光源。

2.2 单色器

单色器是将光源发射的复合光分解为单色光的装置。一般由5部分组成：入光狭缝、准光气(一般由透镜或凹面反光镜使入射光成为平行光束)、色散器、投影器(一般由一个透镜或凹面镜将分光后的单色光投影至出光狭缝)、出光狭缝。

色散器是单色器的核心部分，常用的色散元件是棱镜或光栅。

棱镜由玻璃或石英制成，玻璃棱镜色散能力强，但吸收紫外光，只能用于350-820nm波长的分析测定，在紫外区必须用石英棱镜。

光栅的特点是：色散均匀，呈线性，光度测量便于自动化，工作波段广。

2.3 吸收池

也称为比色皿，是盛放样品溶液的容器，具有两个互相平行、透光且具有精确厚度的平面。玻璃吸收池光程长度一般为1cm，也有0.1-10cm的。

由于吸收池厚度存在一定误差，其材质对光不是完全透明，在做定量分析时，对吸收池应做配套性试验，试验后标记出放置方向。紫外光区数值不跳为石英。

2.4检测系统

检测系统包括检测器和记录显示装置。检测器是一种光电转换设备，将光强度转变为电信号显示出来。常用的检测器有光电池、光电倍增管和光二极管阵列检测器等。

光电池的光电流较大，不用放大，用于初级的分光光度计上，疲劳效应严重。

光电倍增管利用二次电子发射来放大光电流，放大倍数可高达10⁸倍，应用最为广泛。

光二极管阵列检测器由于全部波长同时被检测，扫描速度快，可在0.1s内完成对190-800nm波长范围的扫描。

记录显示装置包括放大器和结果显示装置。70年代采用数字读出装置。现代在主机中装备有微处理机或外接微型计算机，控制仪器操作和处理测量数据，装有屏幕显示、打印机和绘图仪等。

三、测量条件的选择

3.1 显色反应及显色条件的选择

进行比色分析或光度分析时，首先要把待测组分转变成有色化合物，然后进行比色或光度测定。将待测组分转变成有色化合物的反应叫显色反应，与待测组分形成有色化合物的试剂称为显色剂。

3.1.1 显色反应的选择

显色反应分两类，即络合反应和氧化还原反应，络合反应是最主要的显色反应。选用的原则是：

1) 选择灵敏的显色反应。摩尔吸光系数ε的大小是显色反应灵敏度高低的重要标志，因此应当选择生成的有色物质的ε较大的显色反应。一般来说，当ε为10⁴-10⁵时，可认为该反应灵敏度较高。

2) 尽可能选择选择性好的显色剂。即显色剂仅与一个组分或少数几个组分发生显色反应。

3) 显色剂在测定波长处无明显吸收。通常把两种有色物质最大吸收波长之差称为对比度，一般要求显色剂与有色化合物的对比度在60nm以上。

4) 反应生成的有色化合物组成恒定，化学性质稳定。

3.1.2 显色条件的选择

吸光光度法测定的是显色反应达到平衡后溶液的吸光度，因此要得到准确的结果，必须从研究平衡着手，了解影响显色反应的因素，控制适当的条件，使显色反应完全和稳定。

1) 根据溶液平衡原理，有色络合物的稳定常数越大，显色剂过量越多，越有利于待测组分形成有色络合物。但是过量显色剂的加入有时会引起副反应，对测定反而不利。

2) 酸度对显色反应的影响是多方面的。一种金属离子与某种显色剂反应的适宜酸度范围是通过实验来确定的。确定的方法是固定待测组分及显色剂的浓度，改变溶液pH值，测定其吸光度，作出吸光度-pH值关系曲线，选择曲线平坦部分对应的pH值作为测定条件。

3) 显色反应一般在室温下进行，有的反应需要加热，以加速显色反应，使之进行完全。

4) 大多数显色反应需要经过一定的时间才能完成，其长短与温度的高低有关，也会受到空气的氧化或发生光化学反应使眼色颜色减弱。因此必须通过实验作出在一定温度下的吸光度-时间关系曲线，得到适宜的显色时间。

3.1.3 干扰的消除

1) 干扰的类型

光度分析中，共存离子如本身有颜色，或与显色剂作用生成有色化合物，都将干扰测定。

A.干扰离子本身有颜色

B.干扰离子本身无颜色，但能与显色剂反应生成稳定的配合物。若生成的配合物有色则直接干扰测定，若生成的配合物无色，也降低了显色剂的浓度，影响被测离子与显色剂的反应，而产生误差。

C.干扰离子与被测离子反应生成配合物或沉淀，影响被测离子的测定。

2) 消除干扰的方法

A.控制溶液酸度。

B.加入掩蔽剂与干扰离子形成更稳定的化合物，使干扰离子不再产生干扰。

C.里用参比溶液消除某些有色干扰离子的影响。

D.选择适当的工作波长以消除干扰。

E.采用适当的分离方法。

3.2 吸光度测量条件的选择

3.2.1 入射光波长的选择

应根据吸收光谱曲线，选择溶液具有最大吸收时的波长作为入射光的波长。

如显色剂与钴络合物在420nm波长处均有最大吸收峰。如用此波长测定钴，则未反应的显色剂会造成干扰而降低测定的准确度。因此必须选择在500nm波长处测定，在此波长下显色剂不发生吸收。而钴络合物则有一吸收平台。

3.2.2 参比溶液的选择

1) 如果仅待测物与显色剂的反应产物有吸收，可用纯溶剂作参比溶液。

2) 如果显色剂或其他试剂略有吸收，应用空白溶液(不加试样的溶液)作参比溶液。

3) 如试样中其他组分有吸收，但不与显色剂反应，则当显色剂无吸收时，可用试样溶液作参比溶液，当显色剂略有吸收时，可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂，以此溶液作参比溶液。

3.2.3 吸光度读数范围的选择

实践证明，吸光度在0.2-0.5内时，测量的相对误差最小。

可用两种方法来调整被测溶液的吸光度：

1)控制被测溶液的浓度。如改变取样量，改变溶液的浓缩倍数或稀释倍数。

2)选择不同的比色皿。吸光度小的溶液要用光程长的比色皿，吸光度大的溶液要用光程短的比色皿。

四、应用

4.1 应用领域

4.1.1 高含量组分测定-示差法

当待测组分含量较高时，测得的吸光度值常常偏离朗伯-比尔定律。即使不发生偏离，也因为通常采用纯溶剂作参比溶液(普通光度法)，使测得的吸光度太高，超出适宜的读数范围而引入较大的误差。采用示差法就能克服这一缺点。

但应用示差法时，要求仪器光源有足够的发射强度或能增大光电流放大倍数，以便能调节参比溶液透光度为100%。这就要求仪器单色器质量高，电光学系统稳定性好。

4.1.2 多组分分析

应用紫外可见分光光度法，常常可能在同一试样溶液中不进行分离而测定一个以上组分。

假定溶液中同时存在两种组分x和y，其吸收光谱一般有重叠和不重叠两种情况。

1) 不重叠的测定组分相互不产生干扰。

2) 若吸收光谱重叠，在波长为λ1和λ2时分别测定吸光度A1和A2，由吸光度值的加和性得到联立方程，通过解联立方程求得各浓度值。

4.2 定量方法

紫外可见分光光度分析的定量依据是光吸收定律，但具体操作方法却有多种

4.2.1 标准曲线法

即工作曲线法，适用于大量重复的样品分析，是工厂控制分析中应用最多的方法。

根据光吸收定律，对于一种有色化合物，ε是一个定值，若把光程L也固定，那么吸光度A就和溶液的浓度c成正比，也就是说吸光度A和浓度c呈线性关系。

配制一系列适当浓度的标准溶液，显色后分别测定其吸光度，把吸光度A对浓度c作图，即得工作曲线。

4.2.2 直接比较法

直接比较法其实质也是工作曲线法，是一种简化的工作曲线法。

配一个已知被测组分浓度为c_s的标样，测其吸光度为A_s，在同样条件下再测未知样品的吸光度为A_x，通过计算可求出未知样品的浓度c_x。

A_s=εc_sL

A_x=εc_xL

由于溶液性质相同，比色皿厚度一样，所以A_s/A_x=c_s/c_x

式中：

c_s-已知被测组分的浓度，mol/L；

c_x-未知样品的浓度，mol/L；

A_s-已知被测组分的吸光度；

A_x-未知样品的吸光度。

直接比较法简化了绘制工作曲线的步骤，适用于个别样品的测定。

操作时应注意配制标样的浓度要接近被测样品的浓度，这样能减少测量误差。

4.2.3 标准加入法

标准加入法是工作曲线的一种特殊应用。

选择适当的显色条件，先测定浓度为cx的未知样品吸光度为A_x，再向未知样品中加入一定量的标样，配置成浓度为c_x+Δc₁、c_x+Δc₂……一系列样品，分别显色后再测定吸光度为A₁、A₂……最后在坐标纸上绘图，以吸光度A为纵坐标，以浓度c为横坐标，分别画出Δc₁、Δc₂所对应的A₁、A₂等各点，连成直线后延长，与横轴的交点c_x也就是未知样品的浓度c_s。

应用标准加入法时要注意，加入的标样浓度要适当，使画出的曲线保持适当角度，浓度过大或过小都会带来测量误差。

这种方法操作比较麻烦，不适于作系列样品分析，但它适用于组成比较复杂，干扰因素较多而又不太清楚的样品，因为它能消除背景的影响。

4.3 紫外可见分光光度计使用中的注意点

4.3.1 保护光源

光源灯有一定的寿命，仪器不工作时不要开灯，若工作间歇时间短，可不关灯。

一旦停机，则要待灯冷却后再重新启动，并预热15min。

灯泡发黑或亮度明显减弱或不稳定时，就及时更换。

经经紫外光照射后形成结痕可用无水乙醇去除。

4.3.2 保证合适的工作环境

温度和湿度是影响仪器性能的重要因素。

不适宜的温度和湿度可引起机械部件的锈蚀，使金属镜面的光洁度下降，引起仪器机械部分的误差或性能下降；

造成光栅、反射镜、聚焦镜等光学部件的铝膜锈蚀，产生光能不足、杂散光、噪声等；

甚至使仪器停止工作，从而影响仪器寿命。维护保养时应定期加以校正温度和湿度。

实验室，特别是地处南方地区的实验室，应具备四季恒温的仪器室，配备恒温设备。

环境中的尘埃和腐蚀性气体也可以影响机械系统的灵活性、降低各种限位开关、按键、光电耦合器的可靠性，也是造成光学部件铝膜锈蚀的原因之一。

因此必须定期清洁，保障环境和仪器内卫生条件，防尘。

4.3.3 定期除尘、调校

仪器使用一定时间后，内部会积累一定量的尘埃，最好由维修工程师或在工程师指导下定期开启仪器外罩对内部进行除尘工作，同时将各发热元件的散热器重新紧固，对光学盒的密封窗口进行清洁，必要时对光路进行校准，对机械部分进行清洁和必要的润滑，最后恢复原状，再进行一些必要的检测、调校和记录。

4.3.4 正确使用比色皿

拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。

清洗比色皿时，先用水冲洗，再用蒸馏水洗净。若被比色皿被有机物沾污，可用盐酸-乙醇混合洗涤液(1:2)浸泡片刻，再用水冲洗。每次做完实验应立即洗净比色皿。

比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸吸干，以保护透光面。

测定有色溶液吸光度时，一定要用有色溶液洗比色皿内壁几次，以免改变有色溶液的浓度。在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按由稀到浓的顺序测定，以减少测量误差。

若分光光度计噪音比较大，有可能是光源灯泡使用时间超过寿命期，可更换光源灯泡。

若自检时提示波长自检出错，有可能是自检过程中打开过仪器样品室的盖子，可关上仪器样品室盖子，重新自检。