实验报告：

一、95-D(高转移肺癌细胞)分离与培养：

    1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小；

    2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

    3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；

    4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

    5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；

二、免疫荧光鉴定：

    1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

    2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

    3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

    4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗（Abbioscience公司），然后将其放在4℃箱中孵育细胞过夜；

    5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

    6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

特性：

安全性：所有肿瘤和病转染的细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需高压灭菌后方能丢弃。收到细胞后，在倒置镜下好是在4X物镜)观察整个细胞生长情况

（一）如果细胞未长满，用75%酒精喷洒整个瓶消后放到超菌台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，吸出培养液，换 10ml新鲜培养液后继续培养。

(二)如果细胞已长满，即可进行传代培养。具体步骤如下：

1. 弃去培养液，用PBS（不含钙,镁离子）洗1-2次。

2. 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，倒放于37℃培养箱1-3分钟预热，之后翻转培养瓶10-30秒后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量完全培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加完全培养基，轻轻打匀后吸出一半，分到新的培养瓶中。

细胞特性：

1)组织来源于实验动物的正常眼组织。

2)细胞鉴定：细胞角蛋白-18(CK-18)免疫荧光染色为阳性。

3)经鉴定细胞纯度高于90%。

4)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

5)细胞生长方式：上皮样，不规则细胞，贴壁培养。

注意事项：

1、观察细胞zui好在低倍镜（4或5X物镜)下进行，否则不能准确判断细胞的传代密度。看细胞的形态请在10X或20X物镜下。

2、瓶中运输培养基不能重复再用,请换用加双抗的新培养基，细胞冻存后,培养基中可不加任何抗生素。

3、有些细胞贴壁不牢，如发现贴壁细胞有脱落，可离心吹打后接种到新瓶内。

4、收到细胞后，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请及时与我们。

ABCB11 (Bile salt export pump) ELISA KITPorcine PECAM-1(Platelet/Endothelial Cell Adhesion Molecule 1) ELISA KitN,N'-琥珀酰亚胺基碳酸酯组织环氧化酶（CYCLOOXYGENASE-1）活性比色法定量检测试剂盒

BCDIN3D (Pre-miRNA 5′-monophosphate methyltransferase) ELISA KITPorcine FABP4(Fatty acid-binding protein, adipocyte) ELISA KitN-乙酰-DL-甲硫氨酸体液环氧化酶（CYCLOOXYGENASE-1）活性比色法定量检测试剂盒

BCL10 (B-cell lymphoma/leukemia 10) ELISA KITPorcine VCAM1(Vascular cell adhesion protein 1) ELISA KitN-乙酰-DL-甲硫氨酸细胞环氧化酶（CYCLOOXYGENASE-2）活性比色法定量检测试剂盒

BNIPL (Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa-interacting protein 2-like protein) ELISA KITPorcine PMAP23(Antibacterial peptide PMAP 23) ELISA KitN-Boc-D-蛋氨酸组织环氧化酶（CYCLOOXYGENASE-2）活性比色法定量检测试剂盒

ABCC11 (ATP-binding cassette sub-family C member 11) ELISA KITPorcine HER2(Epidermal growth factor receptor 2) ELISA KitN-Boc-D-蛋氨酸体液环氧化酶（CYCLOOXYGENASE-2）活性比色法定量检测试剂盒

ATRN(Attractin) ELISA KitPorcine SAA(Serum amyloid A protein) ELISA KitN-Boc-D-蛋氨酸细胞环氧化酶（CYCLOOXYGENASE-1/2）总活性荧光定量检测试剂盒

BNC1 (Zinc finger protein basonuclin-1) ELISA KITPorcine ANG1(Angiopoietin-1) ELISA Kit烟酸组织环氧化酶（CYCLOOXYGENASE-1/2）总活性荧光定量检测试剂盒

BTF3L4 (Transcription factor BTF3 homolog 4) ELISA KITPorcine CASP3(Caspase 3) ELISA Kit烟酸体液环氧化酶（CYCLOOXYGENASE-1/2）总活性荧光定量检测试剂盒

PCBP2 ELISA KitTPST2  酪蛋白硫酸转移酶2抗体三乙二醇人参皂苷Rg1进口/国产BRLF1  立即早期癌因BRLF1抗体（鼻咽癌因）含量：HPLC≥98%

ICTP(Cross-linked C-terminal telopeptide of Collagen alpha-1(I) chain) ELISA KitAGPA/Alpha 1 Acid Glycoprotein  α1酸性糖蛋白1/类粘蛋白1抗体对叔丁基甲苯人参皂苷Rg2进口/国产ADAR1 (C-terminus)  双链RNA苷酸脱氨酶抗体（C端）含量：HPLC≥98%

PCDH11Y ELISA KitPIWIL4  piwi样4蛋白抗体对叔丁基甲苯人参皂苷Rg3进口/国产Ractopamine /PAYLEAN (1B12)  小鼠抗莱克多巴单克隆抗体含量：HPLC≥98%

PCDH11X ELISA KitCARD7/NALP1  凋亡加强结构域蛋白7抗体三甲基乙醛人参皂苷Rh1进口/国产Cellulase  纤维酶含量：HPLC≥98%

PCDHA3 ELISA KitNALP4  癌/睾丸抗原58抗体三甲基乙醛人参皂苷Rh2进口/国产Pectinesterase  果胶酶抗体含量：HPLC≥98%

PCDHA2 ELISA KitNLRP10  富含亮氨酸重复结构域蛋白10抗体三甲基乙醛人参皂苷Rh3进口/国产DLK1/Delta/DLL1 (C-terminus)  穿膜蛋白DLK1抗体（C端）含量：HPLC≥98%

PCDH9 ELISA Kitbeta COP  β衣被蛋白抗体三甲基乙醛人参皂苷Rc进口/国产ADD1/alpha Adducin  内收蛋白a1抗体含量：HPLC≥98%

PCDHGB3 ELISA KitCaspase 4/Caspase 11  半胱胺酸蛋白酶4/11抗体柠檬酸三乙酯人参皂苷Re进口/国产Gibberellins  牛磺酸/β-氨磺酸抗体含量：HPLC≥98%

特性：

安全性：所有肿瘤和病转染的细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需高压灭菌后方能丢弃。收到细胞后，在倒置镜下好是在4X物镜)观察整个细胞生长情况

（一）如果细胞未长满，用75%酒精喷洒整个瓶消后放到超菌台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，吸出培养液，换 10ml新鲜培养液后继续培养。

(二)如果细胞已长满，即可进行传代培养。具体步骤如下：

1. 弃去培养液，用PBS（不含钙,镁离子）洗1-2次。

2. 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，倒放于37℃培养箱1-3分钟预热，之后翻转培养瓶10-30秒后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量完全培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加完全培养基，轻轻打匀后吸出一半，分到新的培养瓶中。