正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

辅酶ⅡNADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NADP+和 NADPH 含量测定可以计算 NADP(NADPH + NADP+  )含量和 NADPH/NADP+比值，其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一，而且在 PPP 途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。

测定原理

分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NADP+和 NADPH。NADPH 通过 PMS 的递氢作用，使氧化型噻唑蓝(MTT)还原为甲瓒，570nm 下检测吸光值，从而测定 NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原 NADP+为 NADPH，从而检测 NADP+含量。

所需的仪器和用品

酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

酸性提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；

碱性提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 10 mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 支，-20 ℃保存，用时加入 3mL 蒸馏水，混匀；溶解后 4 ℃保存一周；

试剂三：粉剂×1 支，-20℃保存，用时加入 3mL 蒸馏水，混匀；溶解后 4℃保存一周；

试剂四：粉剂×1 支，4 ℃保存，用时加入 3mL 蒸馏水，混匀；溶解后 4℃保存一周；

试剂五：液体 3.6mL×1 支，4 ℃保存；

试剂六：液体 30mL×1 瓶，4 ℃保存；

试剂七：液体 50mL×1 瓶，4 ℃保存。

1、血清(浆)中 NADP+和 NADPH 的提取

NADP+的提取：按照血清(浆)体积(mL)：酸性提取液体积(mL)为 1：5～10 的比例(建议取约 0.1mL 血清(浆)，加入 1mL 酸性提取液)，95℃水浴 5min(盖紧，以防止水分散失)； 冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

NADPH 的提取：按照血清(浆)体积(mL)：碱性提取液体积(mL)为 1：5～10 的比例(建议取约 0.1mL 血清(浆)，加入 1mL 碱性提取液)，95℃水浴 5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织中 NADP+和 NADPH 的提取

NADP+的提取：按照组织质量(g)：酸性提取液体积(mL)为 1：5～10 的比例(建议取约 0.1g 组织，加入 1mL 酸性提取液)，冰浴研磨，95℃水浴 5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和， 混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

NADPH 的提取：按照组织质量(g)：碱性提取液体积(mL)为 1：5～10 的比例(建议取约0.1g 组织，加入 1mL 碱性提取液)，冰浴研磨，95℃水浴 5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3、细胞或细菌中 NADP+和 NADPH 的提取

NADP+的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量(10⁴ 个)：酸性提取液体积(mL)为 500～1000：1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液)， 超声波破碎(冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次)，95℃水浴 5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

NADPH 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量(10⁴ 个)：碱性提取液体积(mL)为 500～1000：1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液)， 超声波破碎(冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次)，95℃水浴 5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 570nm，蒸馏水调零。

2、 加样表(在 1.5mL 棕色 EP 管中按下表依次加样)：

充分混匀，静置 5min 后，20000g，25℃离心 5min，弃上清，沉淀中加入：

混匀，取 200μL 转移至微量石英比色皿或 96 孔板中，570nm 下读取对照吸光值 A1 和测定管吸光值 A2，计算△A=A2-A1。

注意事项

1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。

2、对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六；测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应 20min 后再加试剂六。

3、反应过程中注意避光。

4、若 NADP+测定中△A(A2-A1)≤0.0144，NADPH 测定中△A(A2-A1)≤0.0259，说明样本中辅酶含量较低，已低于检测限，可做如下调整：(1)将测定管避光静置时间 20min 延长到 60min；(2)在提取阶段增加取样量，即取 0.2g 样本或 0.2mL 样本加入 1mL 提取液。

5、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒 100 管保证测 48 个 NADP+或 NADPH.

NADP+和 NADPH 含量的计算

(一)NADP+含量的计算

标准条件下的回归曲线为 y = 0.0985x + 0.0144，R2 = 0.9998；其中 y 为△A，x 为 NADP+浓度 nmol/mL

1、血清(浆)中 NADP+含量计算

NADP+含量(nmol/mL)=[ (△A -0.0144)÷0.0985×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 203×(△A -0.0144)

2、组织、细菌或细胞中 NADP+含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NADP+ (nmol/mg prot)=[(△A -0.0144)÷0.0985×V1) ]÷(V1×Cpr)= 10.2×(△A -0.0144)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NADP+ (nmol/g 鲜重)= [(△A -0.0144)÷0.0985×V1)]÷(W×V1÷V2)=20.3×(△A -0.0144)÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NADP+ (nmol/10⁴ cell)=[(△A -0.0144)÷0.0985×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.04×(△A -0.0144)

(二)NADPH 含量的计算

标准条件下的回归曲线为 y = 0.6198x + 0.0259，R2  = 0.9977；其中 y 为△A，x 为 NADPH浓度 nmol/mL

1、血清(浆)中 NADPH 含量计算

NADPH 含量(nmol/mL)= [(△A -0.0259)÷0.6198×V1)]÷(V3×V1÷V2)= 32.3×(△A -0.0259)

2、组织、细菌或细胞中 NADPH 含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NADPH (nmol/mg prot)=[ (△A -0.0259)÷0.6198×V1)]÷(V1×Cpr)= 1.6×(△A -0.0259)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NADPH (nmol/g  鲜重)=[(△A -0.0259)÷0.6198×V1) ]÷(W×V1÷V2)=3.2×(△A -0.0259)÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NADPH (nmol/10⁴ cell)=[(△A -0.0259)÷0.6198×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.006×(△A -0.0259)

V1：加入反应体系中样本体积，0.02mL；V2：加入提取液体积，2mL；V3：加入血清(浆) 体积：0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。

注意：最低检测限为 0.01nmol/mL 或 0.01nmol/g 鲜重或 0.001nmol/mg prot