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3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)试剂盒
3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)试剂盒图片
包装: 96样
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产品别名:3-磷酸甘油醛脱氢酶试剂盒(微量法)
产品介绍

          GAPDH 催化 3-磷酸甘油醛氧化生成 1,3-二磷酸甘油酸,是糖酵解途径的关键酶,与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关,在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。

测定原理
       3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和 ATP 生成 1,3 二磷酸甘油酸。GAPDH 逆向催化 1,3二磷酸甘油酸和 NADH 生成 3 磷酸甘油醛、无机磷和 NAD,340nm 处测定 NADH 的减少量可反映 GADPH 活性的高低。

需自备的仪器和用品
       分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制
提取液一:液体 100mL×1 瓶,4°C保存。
提取液二:液体 100mL×1 瓶,4°C保存。
试剂一:粉剂×1 瓶,-20°C保存;
试剂二:液体 20mL×1 瓶,4°C保存;
试剂三:液体 14uL×1 支,4°C保存;

组织样本的前处理
①总 GAPDH 酶提取:建议称取约 0.1g 样本,加入 1mL 提取液一,冰浴匀浆后超声破碎(冰浴,200W,破碎 3s,间歇 7s,总时间 1min),然后 4°C,8000g 离心 10min,取上清测定。
②胞浆和叶绿体 GAPDH 酶的分离:按照植物组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10的比例(建议称取约 0.1g 样本,加入 1mL 提取液一),冰浴匀浆后于 4°C,200g 离心 5min,弃沉淀,取上清在 4°C,8000g 离心 10min,取上清用于测定胞浆 GAPDH 酶活性,取沉淀加 1mL 提取液二,震荡溶解后超声破碎(冰浴,200W,破碎 3s,间歇 7s,总时间 1min),然后 4°C,8000g 离心 10min,取上清测定叶绿体中 GAPDH 酶活性。
建议测定总 GAPDH 酶活性,按照步骤①提取粗酶液,若需要分别测定胞浆和叶绿体中的GAPDH,则按照步骤②提取粗酶液。

细菌或培养细胞的前处理
       先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液一),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4°C离心10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定
(1)工作液的配制:将试剂二全部倒入试剂一瓶中,充分溶解,37°C(哺乳动物)或 25°C(其
它物种)预热 10 分钟;用不完的试剂分装后-20°C保存,禁止反复冻融。
(2)在试剂三中加入 500μL 蒸馏水,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20°C保存,禁
止反复冻融。
(3)在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 5μL 样本、5μL 试剂三和 190μL 工作液,混匀,
加入最后一个试剂的同时开始计时,记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 5min20s 后的吸
光值 A2,计算 ΔA=A1-A2。

GAPDH 活性计算
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1)按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
GAPDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位的定义:每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
GAPDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=1286×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每一万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
GAPDH(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500 ×V 样÷V 样总) ÷T=2.572×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:
比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.005 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:
反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总
数,500 万。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
(1)按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
GAPDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=2572×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位的定义:每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
GAPDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=2572×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每一万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
GAPDH(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500 ×V 样÷V 样总) ÷T=5.144×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:
96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.005 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;
T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细
胞总数,500 万。   

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