试验操作方法：

1  血凝（HA）试验操作方法

1.1 在V型微量反应板中，每孔加0.025ml PBS溶液。

1.2 第1孔加入0.025ml抗原，依次作0.025ml的对倍稀释至第11孔；为精确计算血凝单位，病毒悬液开始需作一系列密集稀释，如1/3、1/4、1/5、1/6等。

1.3 每孔加0.025ml PBS溶液。

1.4 每孔加0.025ml 1%（V/V）鸡红细胞悬液。

1.5 将反应板在振荡器上振荡1~2分钟或轻叩反应板混合反应物，室温（20~25℃）静置15~30分钟或2~8℃ 45~60分钟，当对照孔的红细胞显著呈纽扣状时判定结果。

1.6 结果判定  将反应板倾斜60°，观察红细胞有无呈泪珠样流淌，完全无泪珠样流淌（凝集）的稀释倍数为血凝效价。表示1个HA单位（HAU），再根据开始的稀释倍数精确计算血凝效价。

2  血凝抑制（HI）试验操作方法

2.1 根据HA测定的效价，计算配制4个血凝单位（4HAU）抗原。

2.2 反应板中每孔加入0.025ml PBS。

2.3 第1孔中加入0.025ml血清。

2.4 在反应板上将血清做横向0.025ml的对倍稀释，至第10孔。

2.5 在第1孔至第11孔中，每孔加入0.025ml的4HAU抗原，室温下（20~25℃）静置30分钟或2~8℃ 45~60分钟。

2.6 每孔加入0.025ml 1%（V/V）的鸡红细胞悬液，轻晃混匀后，室温（20~25℃）静置20~40分钟或2~8℃ 45~60分钟，当对照孔红细胞呈显著纽扣状时判定结果。

2.7 结果判定  以完全抑制4HAU抗原的血清稀释倍数判为该血清HI效价。当阳性血清的HI效价与已知效价误差不超过1个滴度，阴性血清效价不高于1:4时，试验方可成立。被检样品HI效价≤1:4判为阴性；等于1:8判为可疑（可疑样品应重检，重检效价≥1:8判为阳性，＜1:8判为阴性）；≥1:16判为阳性。

注意事项：

（1）HA和HI试验影响因素甚多，应严格控制试验条件，准确控制红细胞悬液和抗原工作浓度，同时应严格控制温度和作用时间。

（2）用pH值7.0~7.2的PBS作稀释液。

（3）抗原和阴、阳性血清若有污染，应废弃。

（4）使用时应先测抗原的血凝价，根据所测结果，配制4个血凝单位的抗原，配好后的抗原应在2小时内用完。

（5）抗原开封后2~8℃保存，应不超过3个月。切忌反复冻融。

贮藏与有效期：
  2~8℃保存，抗原、阳性血清和阴性血清有效期均为24个月。