产品及特点

小麦矮腥黑穗病菌属中国一类检疫性有害生物，主要危害小麦作物，可造成农作物矮化、分蕖增多等病症。目前有 40多个国家将此病列为检疫性病害。它可通过种子、土壤、空气等多种途径传播，甚至加工成面粉后仍可检出该菌的冬孢子。该菌在土壤中可存活多年，一旦传入将难以根除。分子生物学方法是精确揭示遗传关系较为稳定的方法，在植物病原细菌检测和鉴定中应用最多也是最主要的是专化性引物 PCR技术。本公司开发小麦矮腥黑穗病菌染料法荧光定量 PCR试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供DNA模板。

2、特异性高，引物是根据小麦矮腥黑穗病菌高度保守区设计,不会扩增其他细菌。

3、引物和扩增体系经过优化，灵敏性比常规PCR高100倍。

4、提供无传染性的PCR阳性对照，便于区分假阴性样品。

5、一管式操作，荧光PCR检测，不容易产生环境污染。

6、本产品只能用于科研，本试剂盒足够50次20μL体系的PCR。

规格及成分

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂

样品DNA。

使用方法

一、制备标准曲线样品(以10E1-10⁶拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1、标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。

2、用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

3、在6号管中加入5μL阳性对照(其浓度为1×10⁷拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在5号管中加入5μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在5号管中加入5μL 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁴拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7、用自选方法纯化样品的DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。

8、如果有N个样品，则需要进行N+2个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。

三、设置qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9、如果进行定量分析，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线样品。如果做定性分析，则6个标准曲线样品只选一个做(可以选4号，其余样品不变)。以下只介绍定量分析的反应设置。

10、在标记管中按下表加入各成分：

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR(具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。

四、荧光定量PCR反应参数

五、数据处理

12、设定60℃-96℃范围的熔解曲线分析，排除假阳性。

13、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。

14、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于35。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于35则为阴性，如果小于或等于30则为阳性。如果在30-35之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于35则为阴性，如果小于30，则为阳性。