糜蛋白酶，又称胰凝乳蛋白酶，是胰腺分泌的一种蛋白水解酶，能迅速分解变性蛋白质。糜蛋白酶的功能与胰蛋白酶相似，但是具有分解能力强、毒性低和不良反应小等优点。临床上糜蛋白酶用于痰液稀化，对脓性和非脓性痰液均有效；也用于创伤或手术后伤口愈合，如白内障摘除。

糜蛋白酶催化BTEE水解，产物在256nm有特征光吸收；通过测定256nm光吸收增加速率，来计算糜蛋白酶活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容：

溶液的配制：

1.试剂二：临用前溶于1.6 ml甲醇中，再用水定容至10ml。可分装后-20℃保存，避免反复冻融。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取

1.组织：按照组织质量(g)：提取液体积(ml)1：5-10的比例(建议称取约0.1g组织，加入1ml试剂一进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清即粗酶液。

2.血清(浆)：直接检测。

二、测定操作：

1.紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到256nm，蒸馏水调零。

2.试剂一置于25℃水浴中保温30min。

3.操作表：

将上述试剂分别加入微量石英比色皿/石英96孔板后充分混匀，于256nm处测定初始吸光值A1和3min时的吸光值A2，计算△A=A2-A1。

三、糜蛋白酶活性计算公式：

A、按微量石英比色皿计算：

1.按蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃每毫克蛋白每分钟水解1μmol BTEE为一个酶活单位。

糜蛋白酶活(U/mg prot)= (△A×V反总÷ε÷d)÷(Cpr×V样)÷T=3.8×△A÷Cpr。

2.按样本质量计算

活性单位定义：25度每克样品每分钟水解1μmol BTEE为一个酶活单位。

糜蛋白酶活(U/g鲜重)=(△A×V反总÷ε÷d)÷(W×V样÷V提取)÷T=3.8×△A÷W。

3.按血清(浆)体积计算

活性单位定义：25℃每毫升血清(浆)每分钟水解1μmol BTEE为一个酶活单位。

糜蛋白酶活(U/ml )=(△A×V反总÷ε÷d)÷V样÷T=3.8×△A。

V样：加入反应体系中粗酶液体积，0.02ml；Cpr：粗酶液蛋白浓度，mg/ml，需要另外测定；W：样本鲜重，g；V反总：反应总体积，0.22 ml；V提取：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，3min；ε：BTEE消光系数：0.964 ml/μmol/cm；d：比色皿光径，1cm。

将上述计算公式中的d-1cm改为d-0.6cm(96孔板光径)进行计算即可。

注意事项：

1.当△A大于0.15或者吸光值大于1时，建议将样品稀释后测定。

2.当△A小于0.04时，建议将样品浓缩或者增加样品体积进行测定，注意计算公式除以浓缩倍数或者改变体积。