NAD/NADH定量试剂盒

货号:	AK300
包装:	50T/24S

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产品名称

NAD(H) Quantification Assay Kit

产品介绍

意义：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是一种参与多种氧化还原反应的酶辅因子(辅酶Ⅰ)。NAD 作为电子载体，在氧化态(NAD)和还原态(NADH)之间循环。除了在氧化还原反应中的作用外，NAD 在 ADP 核糖基化反应中起着关键作用，并且是 sirtuins 的底物。辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。NAD 参与细胞物质代谢、能量合成、细胞 DNA 修复等多种生理活动，对机体免疫能力有重要作用。NADH 在维持细胞生长、分化和能量代谢以及细胞保护方面起着重要作用。NAD(H)含量和 NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和 TCA 循环的强弱。较高的 NAD(H)及 NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和 TCA 循环。

原理：分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NAD+和 NADH，NADH 通过 PMS 的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝(MTT)为甲瓒，在 570nm 下检测吸光值；而 NAD+可被乙醇脱氢酶还原为 NADH，进一步采用 MTT 还原法检测，通过吸光值变化即可定量检测辅酶ⅠNAD (H)的含量。

检测方法：分光光度法

产品组成及保存条件：

编号	规格	储存条件
酸性提取液	25mL×1 瓶	4℃保存；
碱性提取液	25mL×1 瓶	4℃保存；
AK300-A	15 mL×1 瓶	4℃保存；
AK300-B	4 mL×1 瓶	4℃保存；
AK300-C	粉剂×1 瓶	-20℃保存，用时加入 4mL 蒸馏水，混匀，剩余试剂 4℃ 保存一周；
AK300-D	粉剂×1 瓶	4℃保存，用时加入 4mL 蒸馏水，混匀，剩余试剂 4℃保存一周；
AK300-E	1.8mL×1 支	4℃保存；
AK300-F	30mL×1 瓶	4℃保存；
AK300-G	50mL×1 瓶	4℃保存；
NAD 标准品	粉剂×1 支	-20℃保存，临用前加入 1.5 mL 蒸馏水，即 2 μmol/mL，将其稀释为 1.25 nmol/mL 的 NAD 标准溶液备用；
NADH 标准品	粉剂×1 支	-20℃保存，临用前加入 1.4 mL 蒸馏水，即 2 μmol/mL，将其稀释为 1.25 nmol/mL 的 NADH 标准溶液备用。

※ 正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

自备用品：

可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1ml 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

NAD+ 和 NADH 的提取：

1. 血清(浆)中 NAD+和 NADH 的提取：

(1)NAD+的提取：按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL)为 1:5～10 的比例(建议取约 0.1mL 血清(浆)，加入 1mL 酸性提取液)，95℃水浴 5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴中冷却后，10000g 4℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

(2)NADH 的提取：按照血清(浆)体积(mL):碱性提取液体积(mL)为 1:5～10 的比例(建议取约 0.1mL 血清(浆)，加入 1mL 碱性提取液)，95℃水浴 5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2. 组织中 NAD+和 NADH 的提取：

(1)NAD+ 的提取：按照组织质量(g):酸性提取液体积(mL)为 1:5～10 的比例(建议取约0.1g 组织，加入 1mL 酸性提取液)，冰浴研磨，95℃水浴 5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴中冷却后，10000g 4℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

(2)NADH 的提取：按照组织质量(g):碱性提取液体积(mL)为 1:5～10 的比例(建议取约0.1g 组织，加入 1mL 碱性提取液)，冰浴研磨，95℃水浴 5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴中冷却后，10000g 4℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3. 细胞或细菌中 NAD+和 NADH 的提取：

(1)NAD+ 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量(10⁴ 个)：酸性提取液体积(mL)为 500～1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液)，超声波破碎 1min(冰浴，强度 20%或 200W，超声 2s，停 1s)，95℃水浴 5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴中冷却后，10000g 4℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

(2)NADH 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量(10⁴ 个)：碱性提取液体积(mL)为 500～1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液)，超声波破碎 1min(冰浴，强度 20%或 200W，超声 2s，停 1s)，95℃水浴 5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴中冷却后，10000g 4℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1. 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 570nm，蒸馏水调零。

2. 在1.5mL 棕色EP 管中按下表依次加入下列试剂

试剂名称	对照管 (μL)	测定管 (μL)	NAD 或 NADH 标准管(μL)	空白管 (μL)
样本	50	50
标准品			50
蒸馏水				50
AK300-A	250	250	250	250
AK300-B	75	75	75	75
AK300-C	75	75	75	75
AK300-D	75	75	75	75
AK300-E	35	35	35	35
AK300-F	500	混匀，室温避光静置20min
AK300-F		500	500	500
充分混匀，静置 5min 后，20000g，25℃离心 5min，弃上清，沉淀中加入：
AK300-G	1000	1000	1000	1000
混匀，570nm 下比色，读取吸光值 ΔA 测定=A 测定管-A 对照管，NAD 标准管的记为 ΔA标准 1=A 标准管 1-A 空白管。NADH 标准管的记为 ΔA 标准 2=A 标准管 2-A 空白管。 (空白管只需做 1-2 次)